Bolivia, antiguo Alto Perú, estaba dividida entre los virreinatos del Perú y del Río de la Plata. Carlos V había dividido el imperio de los Incas en dos partes: Nueva Castilla (Perú) para Francisco Pizarro y Nueva Toledo para Diego de Almagro. En esta última entraba lo que había de ser Bolivia. La duda de si el Cuzco y su región pertenecían a una u otra gobernación originó las guerras entre pizarros y almagros. En ellas murieron trágicamente, por este orden: Diego de Almagro, Francisco Pizarro y Diego de Almagro "El Mozo". Gonzalo Pizarro, por encargo de su hermano, el gobernador Francisco Pizarro, había emprendido la conquista del altiplano. Los indios charcas se defendieron, pero fueron vencidos. Peranzurez o Pedro de Anzurez, fundó la ciudad de La Plata (Chuquisaca) en Charcas, en 1538.
Su nombre aludía a los yacimientos de mineral allí descubiertos. Lope de Aguirre se encontraba en esta expedición. La conquista de la actual Bolivia se emprendió desde Lima y el Cuzco por un lado, y desde Asunción (Paraguay), por otro. Alonso de Mendoza funda en 1548 La Paz, hoy cap. de Bolivia. La creación de la Audiencia de Charcas (1559) fue trascendental. Las Audiencias creadas como tribunales de Justicia, fueron investidas pronto con funciones de gobierno. El virrey Toledo (1570) estructuró el distrito de Charcas organizándolo como entidad política. El embrión de la futura Bolivia estaba en estas cuatro gobernaciones aglutinadas en este distrito de Charcas, aún dependiente de Lima: Chuquisaca, La Paz, Potosí y Cochabamba, con las provincias de Moxos y Chiquitos. En 1662 se fundó la Universidad Mayor, Real y Pontificia de San Francisco, en Chuquisaca (hoy Sucre), centro cultural donde se incubaría la lucha por la independencia.