En la fundación de Buenos Aires. Llegó al Río de la Plata a primeros de enero de 1536, en pleno verano. Para entonces Domingo Martínez de Irala era ya secretario del adelantado. El día 2 de febrero del mismo año el secretario Irala interviene en la fundación del Puerto de Nuestra Señora del Buen Aire, ordenada por el adelantado Don Pedro de Mendoza, en la orilla derecha del río. Era la primera fundación de Buenos Aires. El objetivo principal era remontar el Paraná y abrir una vía de comunicación del Atlántico al Perú. El adelantado va con su secretario Irala y después de fundar varios fuertes lo nombra capitán y lo pone al frente de su bergantín, primer cargo militar que ostenta. Cuando partió la expedición de Juan de Ayolas con el objetivo de llegar por tierra al Perú, dejó a Irala al mando de los bergantines, lo nombró lugarteniente, sustituyéndole en los poderes y facultades conferidas por el adelantado Mendoza, ya enfermo, como su heredero y sucesor en la gobernación. Muerto Don Pedro de Mendoza de enfermedad, y en batalla con los indios Juan de Ayolas su sucesor, quedaba Irala como primera autoridad.