Debido al hecho de ser súbditos de dos de las potencias que tomaron parte en la conquista de América, numerosos vascos se destacarían desde un comienzo en el proceso colonizador. Además, debido a que los vascos se habían especializado tiempo atrás en el comercio marítimo, la navegación y la pesca, este hecho facilitó grandemente su participación en la conquista. De hecho, ya en la primera expedición de Cristóbal Colón nos consta que se enrolaron un buen número de vascos, aunque las naves se aprestaron en Andalucía, dada que era muy intensa la presencia de marineros vascos en los puertos de esa región. Cuando se hundió la nao Santa María y se fundó la primera colonia castellana en América (el Fuerte Navidad), quedaron como pobladores varios vascos, entre ellos el propio contramaestre de la nave, un lekeitiano de sobrenombre "Chachu". No hemos de olvidar, además, los viajes y exploraciones que hicieron los pescadores vascos a lo largo de la Baja Edad Media en el Atlántico norte, en busca de bacalao y ballena, si bien no hay pruebas incontestables que permitan asegurar el viejo mito de que los pescadores vascos habrían llegado a tierras americanas antes de que lo hiciera Colón.
El sistema utilizado por la corona de Castilla para conquistar las Américas también tiene su relevancia a la hora de explicar la participación de los vascos. La conquista no fue una acción directa de la corona, sino una empresa dejada al capital y la iniciativa privada. Normalmente, los conquistadores firmaban unas capitulaciones con la corona, en las que ésta aseguraba sus derechos de soberanía sobre los nuevos territorios, a cambio de concederles amplios derechos políticos y económicos sobre su administración. Una vez hecho esto, los conquistadores eran los encargados de reclutar las huestes que se embarcarían para la conquista, en cuya formación tuvieron más importancia los factores de confianza y paisanaje que la propia calidad militar de las tropas. Por este motivo, generalmente ocurría que las huestes estaban compuestas en su mayor parte por gentes del mismo origen geográfico y cultural del conquistador.
Suele dividirse la conquista de América a lo largo del siglo XVI en tres grandes etapas. A las tres primeras décadas, de 1492 a 1520, se las suele denominar como etapa de las grandes exploraciones. Durante estos años no se conquistaron grandes regiones, aparte de algunas islas y fortines en el ámbito del mar Caribe, desde las que partían expediciones de "rescate", es decir, de comercio con los habitantes de las regiones costeras aledañas. Fue en estos viajes en los que se consolidó el concepto de América como un "Mundo Nuevo", y se delinearon las líneas principales de la costa del nuevo continente. Un ejemplo de estos viajes es el comandado por los armadores Sancho Ortiz de Urruela y Juan de Urrutia que obtuvieron permiso para hacer una expedición de rescate por la costa de Cumaná en 1519. Otro navegante vasco que se destacó en esta etapa fue Juan Sebastián Elcano (Getaria, 1476-1526), quien se convertiría en el capitán de la nave que dio la primera vuelta al mundo, entre 1519 y 1522. En un principio, el comandante de la expedición que partió del puerto de Sevilla era el portugués Fernando Magalhães. Esta expedición encontró la ruta del océano Atlántico al Pacífico por el estrecho de Magallanes, y tras arribar a las islas Filipinas y Molucas en Asia, regresó a Europa bordeando las costas de la India y África.
La segunda etapa se inició con la conquista del imperio azteca. Después de que de las cenizas de su capital, Tenochtitlán, se edificara la ciudad de México como capital de la colonia de Nueva España, se acrecentó el número de expediciones que, partiendo de allí, buscaron extender las conquistas hacia el norte y el sur del territorio. Más al norte de México, en la conquista de Nueva Galicia se destacó Cristobal de Oñate (Gasteiz, 1504-1567) fundador de la actual ciudad de Guadalajara (llamada inicialmente Espíritu Santo, 1532). Junto con Oñate llegó a la región un amplio grupo de vascos: Santiago Aguirre, Juan Anuncibay, Alfonso Gaztañaga, Miguel Landeta, Martin de Renteria, etc. El propio Oñate fundaría la ciudad de Zacatecas en 1948, ayudado por Juan de Tolosa y Diego de Ibarra, tras descubrirse en los alrededores una importante mina de plata.
Las exploraciones continuaron hacia el norte. En 1563 un grupo capitaneado por el eibarrés Juan de Ibarra que partió en busca de la tierra mítica de Cíbola fundaría la ciudad de Durango como capital de un amplio territorio que recibió el nombre de Nueva Vizcaya. Juan de Oñate, el hijo criollo americano de Cristóbal (Pánuco, 1550-1626), siguió los pasos de su padre y conquistó en 1598 el territorio de Nuevo México (actualmente en los Estados Unidos). Juan de Montaño (Portugalete, 1505 - ?) tomó parte en la expedición que llegó en 1535 a la península de California, que recibiría su nombre de un conocido libro de caballería del momento.
En Sudamérica, por su parte, el alavés Pascual de Andagoya (Andagoia, 1495-1548) capitaneó el primer intento de conquista de Perú. Tras haber participado en diversas campañas en Centroamérica, en 1519 se dirigió al sur, a través de la costa de Colombia, con un grupo de 400 soldados. Cuando fue informado de la existencia de un reino denominado "Birú", su intento acabaría en fracaso (1522), si bien las noticias que difundió sobre dicho reino permitieron que tres años más tarde Almagro y Pizarro organizaran la expedición que lograría en poco tiempo la caída del imperio de los incas.
Tras materializarse la conquista del Perú, el proceso se internó en una tercera fase. Eran cada vez más los aventureros que querían tomar parte en la conquista, atraídos por el deseo de repetir lo acontecido en Perú y México, poniendo su atención en aquellas regiones del continente que todavía les eran desconocidas a los europeos. En el hemisferio sur partieron numerosas expediciones desde Perú en busca del reino mítico del Dorado, que se situaría en la zona colombiana; o de la legendaria ciudad de los Césares del Plata. Es muy conocida, entre éstas, la expedición que salió en 1560 a explorar el río Amazonas , bajo el mando del navarro Pedro de Ursua (Baztan, 1526-1561) con el objetivo de llegar a El Dorado. Fueron numerosos los vascos que se enrolaron en esta expedición, entre ellos el oñatiarra Lope de Aguirre oñatiarra (1518-1561) . Durante casi dos años recorrerían el río más largo de Sudamérica, con el asesinato del propio jefe de la expedición y una declaración de alzamiento contra el rey Felipe II, que finalizaría con su derrota a manos de los castellanos en Venezuela. En la conquista de Chile, iniciada en 1557 por el gobernador Hurtado de Mendoza, se destacaría el soldado y escritor madrileño de origen vizcaíno Alonso de Ercilla (1533-1594), no solo por haber tomado parte en las principales batallas contra los indígenas, sino sobre todo por haber escrito, a su regreso a Europa, el poema La Araucana en la que hizo una descripción lírica de la lucha entre castellanos e indígenas.
Es, sin embargo, la región del Río de la Plata el lugar en el que se aprecia una mayor impronta de los conquistadores vascos. Cuando en 1534 partió del puerto de Sanlúcar el capitán andaluz Pedro de Mendoza con intención de alcanzar la ciudad de los Césares del Plata, en la hueste arreglada para su conquista se encontraba el guipuzcoano Domingo Martinez de Irala (Bergara, 1509-1556). Tras fundar la ciudad de Buenos Aires en 1536, Mendoza regresaría a España dejando como responsable en su nombre a Irala. Éste decidió trasladar a los pobladores de Buenos Aires hacia el interior, a la ciudad de Ascensión en Paraguay, territorio del que sería gobernador desde 1554 hasta su fallecimiento. Pocas décadas más tarde se despertó nuevamente el interés por la región platense, en esta ocasión buscando una ruta que uniera el Peru con los puertos del océano Atlántico. Un veterano de la conquista de Perú, Juan Ortiz de Zarate (Orduña, 1521-1575), tras recibir el nombramiento de gobernador del Río de la Plata, aprestó una armada en 1572. Ortiz de Zarate bautizaría la región como Nueva Vizcaya, si bien este nombre tuvo poca fortuna. Junto con él marchóJuan de Garay, también de Orduña (1528-1583, si bien hay una cierta polémica en cuanto a su lugar de nacimiento, defendiendo algunos que era natural de Villalba de Losa en la provincia de Burgos). Se encargó a Garay de asegurar la ruta fluvial con Asunción a través del río Paraná, y para ello en 1573 fundaría la ciudad de Santa Fe, a mitad de camino, y en 1580 procedería a la segunda y definitiva fundación de Buenos Aires, ya en la costa.
No obstante, las conquistas no se limitaron al continente americano. De hecho, el objetivo de Colón y de los capitanes de los primeros viajes no fue otro que la búsqueda de una ruta directa para llegar a Asia. Cuando se dieron cuenta de la existencia de América, se organizaron diversas expediciones para cruzar el océano Pacífico (conocido por entonces como Mar del Sur) con la intención de llegar a las costas de China e India. La principal consecuencia de estos esfuerzos fue la conquista y colonización del archipiélago de las Filipinas. En dicha conquista se destacaron, nuevamente, dos nombres vascos: Miguel Lopez de Legazpi (Zumarraga, 1502-1572) y Andres de Urdaneta (Ordizia, 1498-1568). Legazpi, como jefe de una armada compuesta de cuatro naves y 380 soldados, realizó entre 1564 y 1572 la conquista ("pacificación", en la terminología oficial de la época) de las islas mayores del archipiélago. Urdaneta, por su parte, fue el encargado de descubrir la ruta de regreso hacia México, o "tornaviaje", asegurando de este modo la comunicación entre ambas colonias.
Finalmente, no puede dejarse sin mención la presencia a lo largo del siglo XVI de los balleneros vascos en las costas de Terranova. Si bien la primera expedición documentada a este territorio es de la segunda década de siglo (una referencia a la venta de bacalao capturado en las Nuevas Tierras por un pescador de San Juan de Luz en 1517), el momento de auge de las pesquerías vascas en Terranova se sitúa entre 1534 y 1608; es decir, hasta los comienzos de la colonización francesa en Quebec. Los vascos levantaron sus campamentos de verano y talleres en la isla de Terranova, a fin de hacer allí la primera manipulación de los derivados de la ballena. Las excavaciones arqueológicas de estos campamentos, y sobre todo de la nave San Juan (hundida en las costas de Terranova en 1556 y redescubierta en 1978) han ofrecido nuevas luces acerca de las condiciones de vida de los balleneros vascos. Hoy en día Terranova aún mantiene en su toponimia vestigios de su pasado vasco, comenzando por el propio nombre de una de sus principales ciudades, Port-aux-Basques.