Las colecciones del Museo Vasco del Ferrocarril están formadas por cerca de ochenta vehículos de todo tipo. De ellos, sesenta ya han sido completamente restaurados, desde locomotoras de vapor hasta un camión de bomberos, pasando por trolebuses, tranvías, vagones, automotores, etc. En concreto, el Museo Vasco del Ferrocarril dispone de trece locomotoras de vapor, cinco locomotoras eléctricas, nueve locomotoras diesel, doce automotores eléctricos, catorce coches de viajeros, diez vagones de mercancías, un trolebús, seis tranvías, una bateadora de vía, un autobús, un camión de bomberos, una apisonadora, y la maqueta a escala natural de un tren del metro de Bilbao y del futuro tranvía de Bilbao.
Por razones obvias, dada la gran importancia que históricamente han tenido los ferrocarriles de vía métrica en la región, la gran mayoría de los vehículos ferroviarios preservados en el Museo Vasco del Ferrocarril son de ancho métrico. Además, en el momento en que se inició la gestación de esta institución ya estaba en marcha el Museo del Ferrocarril de Madrid, especializado en la recuperación de la historia de los ferrocarriles de vía ancha, por lo que esta parcela de la historia ferroviaria ya estaba cubierta. De hecho, aunque España cuenta con cuatro grandes museos ferroviarios, en realidad, todos ellos son perfectamente complementarios. El de Madrid narra el desarrollo de la red ferroviaria principal en vía ancha, el de Vilanova i la Geltrú (Barcelona) se centra en la tracción, sobre todo en las locomotoras de vapor, y el de Asturias está especializado en los ferrocarriles mineros e industriales, mientras que el Museo Vasco del Ferrocarril es el centro de referencia para los ferrocarriles de vía métrica.
Entre las piezas más singulares de la colección de material móvil del Museo Vasco del Ferrocarril cabe destacar las siguientes:
- Locomotora de vapor Espinal, construida en 1887 en los talleres fundados en Newcastle por Robert Stephenson, inventor de la locomotora de vapor, para el ferrocarril minero de La Orconera (Bizkaia). Esta locomotora es en la actualidad la más antigua en estado de marcha a nivel mundial construida por este reputado fabricante, así como la locomotora de vapor de vía métrica más antigua en servicio en el Estado español.
- Grúa de vapor Grafton, construida en Bedford (Gran Bretaña) en 1920 para la empresa Babcock & Wilcox, probablemente el último vehículo de tracción vapor que trabajó comercialmente en España, ya que operó con regularidad hasta el año 1995.
- Locomotora eléctrica SEFT 101, construida en 1925 por AEG de Berlín para el Ferrocarril de San Sebastián a la Frontera Francesa, el popular Topo. En la actualidad es la más antigua de su tipo en funcionamiento en España.
- Tractor de maniobras Berliet, construido por este reputado fabricante francés en 1925. Es el vehículo ferroviario con motor de combustión interna en funcionamiento más antiguo de España.
Aunque la gran mayoría de estos vehículos han sido recuperados en las diversas explotaciones ferroviarias del País Vasco, muchos de ellos también trabajaron en el pasado en otras regiones españolas. Así, el Museo Vasco del Ferrocarril cuenta con unidades que han funcionado en Asturias, Cantabria, Castilla-León, Castilla-La Mancha, Valencia, Cataluña, Baleares, Madrid, Aragón, Galicia y Andalucía. Además, gracias a la colaboración desinteresada de la empresa Comboios de Portugal (CP), el Museo Vasco del Ferrocarril también ha podido preservar dos de los exponentes más representativos de los ferrocarriles de vía métrica del vecino país, una locomotora de vapor articulada sistema Mallet construida en 1913 y un automotor diesel-eléctrico fabricada por la casa holandesa Allan en 1953. De este modo, el Museo Vasco del Ferrocarril transciende de su propia región para convertirse en el Museo de referencia de los ferrocarriles de vía métrica de España y de la Península Ibérica.
Además de los vehículos antes mencionados, los visitantes del Museo pueden encontrar otros conjuntos de excepcional interés entre los que destaca la colección de relojería ferroviaria Jesús Mínguez considerada la mejor en su género de Europa. También merece la pena conocer el valioso conjunto de uniformes ferroviarios que exponen la evolución de la moda ferroviaria desde 1863 hasta nuestros días o el antiguo taller de mantenimiento del ferrocarril del Urola, el cual constituye un verdadero museo de máquina-herramienta en perfecto estado de funcionamiento. La antigua central eléctrica de transformación nos traslada a un escenario cuya estética recuerda a la película Metrópolis de Fritz Lang.
Al igual que otros museos ferroviarios, las colecciones del Museo Vasco del Ferrocarril se completan con variados conjuntos de faroles, señales, placas de fabricación, maquetas, etc.