Durante esta primera etapa la Universidad de Oñati fue una universidad renacentista más, aunque sin participación alguna del Estado. Mientras se alzaba, un poco de tapadillo, el edificio (1543) -a fin de evitar los celos de otras Universidades y por instrucción de Mercado- las clases comenzaron en la Casa de Hernani, como preceptoría particular.
El curso se abrió en 1545 bajo el rectorado del bachiller Pedro de Gorostarrazu y la docencia de los bachilleres Lope de Burunsano y Gregorio de Mendizabal. Se impartieron clases en las facultades de Teología, Instituta, Cánones, Leyes y Artes, siguiendo el modelo del Colegio de San Bartolomé de Salamanca. Luego llegó a añadirse Medicina, en la que llegaron a graduarse gran número de titulares que ejercieron en el País, y que fue suprimida por orden del visitador Dr. Juárez en 1569.
El fundador murió en Valladolid el año 1548, antes de que pudiese dejar concluida del todo su gran obra, pero en el testamento que nuevamente otorgó en la misma ciudad el 25 de enero del propio año encomendó este cuidado a sus albaceas Miguel Muñoz, obispo de Cuenca y presidente de la Chancillería, y a los licenciados Mercado de Peñalosa y Sancho López de Otalora. Para este efecto, se encargó que formasen un volumen de constituciones que fuesen más conducentes a la mejor dirección del Colegio, guiándose de las de los colegios de San Bartolomé de Salamanca y Santa Cruz de Valladolid. El Colegio presentó el año siguiente al pase del Consejo Real las bulas pontificias de su erección, y aunque este supremo tribunal autorizó su uso, fue con la restricción de que no tuviesen efecto en cuanto a la jurisdicción secular, y que en todo lo demás se rigiese como en las universidades de Cuenca, Sevilla y Toledo. Los testamentarios de Mercado, cumpliendo de su parte el encargo de éste, ordenaron en el año de 1552 un cuerpo de ochenta y siete constituciones por las cuales, no solamente se rigió el Colegio, sino también la Universidad incorporada a él, y las remitieron al rector y colegiales para su puntual observancia, como lo prometieron bajo juramento. Estas constituciones se reformaron en el año de 1569 por el doctor Hernado Juárez de Toledo, del Consejo Real, comisionado para este efecto por el Rey, como patrono del Colegio. De igual orden fueron retocadas en el de 1571 por el Consejo Real, en el de 1589 por Diego Arellano Zapata, canónigo doctoral de la santa iglesia de Coria. En 1590 se compilaron y reformaron los Estatutos.
El universitario se hallaba sometido a una reglamentación casi monástica salvo en el caso de que morase fuera, en posadas especiales, estrechamente vigilado. El aspirante a colegial debía de ser hidalgo y, en principio, pobre, Pese a estas descripciones, hubo, sin embargo, alumnos de sonoros apellidos y se conocieron altercados y alborotos propios de la condición juvenil de los colegiales. Un alumno distinguido durante este período fue el historiador Garibay y Zamalloa. Durante estos años contó con tres centenares de alumnos matriculados que bajaron a 200 a mediados del siglo XVII. También quedaron reducidas las cátedras que en 1606 eran 3 de Teología y 4 de Jurisprudencia. A mediados de este siglo se eliminaron asimismo Teología y Artes. En el segundo tercio de este siglo la institución en la Universidad del Colegio Menor de San Esteban, con 4 cátedras a cargo de sendos jesuitas que duraron hasta 1695, contribuyó a sostener económicamente esta Institución cuya vida fue siempre muy precaria. Especialmente buenas fueron las relaciones con la Universidad de Alcalá con la que se practicó la admisión de grados mayores sin examen.